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技術(shù)文章
用嘌呤霉素篩選細(xì)胞的方法你知道么
  嘌呤霉素是一種蛋白質(zhì)合成抑制劑,它具有與tRNA分子末端類似的結(jié)構(gòu),能夠同氨基酸結(jié)合,代替氨?;膖RNA同核糖體的A位點(diǎn)結(jié)合,并摻入到生長的肽鏈中。用嘌呤霉素篩選細(xì)胞方法如下:
 
  嘌呤霉素篩選細(xì)胞
 
  轉(zhuǎn)染(24孔板進(jìn)行)或電轉(zhuǎn)后培養(yǎng)24小時(shí),按10%密度傳代(傳至36mm平皿),繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí),待細(xì)胞密度增至20%-25%回合時(shí);
 
  去掉培養(yǎng)液,PBS洗一次,加入按照最佳嘌呤霉素篩選細(xì)胞的濃度(殺傷曲線試驗(yàn)確定)配制好的嘌呤霉素篩選細(xì)胞培養(yǎng)基2-3ml。
 
  根據(jù)培養(yǎng)基的顏色和細(xì)胞的存活情況,每隔2天更換一次嘌呤霉素篩選細(xì)胞用培養(yǎng)基(培養(yǎng)基用量為2-4ml,細(xì)胞多,多家培養(yǎng)基,細(xì)胞少,少加培養(yǎng)基),一般在3-1天內(nèi)出現(xiàn)細(xì)胞大量或少量死亡情況(如果轉(zhuǎn)染效率或電轉(zhuǎn)效率高,則死亡少;
 
  如果轉(zhuǎn)染率或電轉(zhuǎn)率低,則死亡多;如果篩選濃度偏低,嘌呤霉素篩選細(xì)胞培養(yǎng)基用量少,細(xì)胞密度大于80%,會(huì)導(dǎo)致大量假陽性克隆)。
 
  如果少選第一周,出現(xiàn)細(xì)胞大量死亡,則在原培養(yǎng)皿中繼續(xù)加入嘌呤霉素篩選細(xì)胞培養(yǎng)基篩選一周;如果刪選第一周,出現(xiàn)細(xì)胞少量死亡,則把細(xì)胞按照10%密度傳代(傳至35mm平皿,傳一個(gè)皿即可,多余細(xì)胞丟棄),利用少選培養(yǎng)基進(jìn)行篩選一周;
 
  篩選第二周結(jié)束后,則把細(xì)胞消化下來。進(jìn)行重點(diǎn)稀釋(10ul培養(yǎng)基中含1個(gè)細(xì)胞,用篩選培養(yǎng)基),把上述10ul細(xì)胞懸液假日96孔板中(提前加入40ul篩選培養(yǎng)基),伊紅加入24孔,4小時(shí)候觀察每個(gè)孔的情況。記錄只含一個(gè)細(xì)胞的孔,含有一個(gè)細(xì)胞的孔用于繼續(xù)篩選,其余孔舍棄;
 
  根據(jù)培養(yǎng)基的顏色和細(xì)胞生長情況換入新的嘌呤霉素篩選細(xì)胞用培養(yǎng)基待細(xì)胞密度為80%時(shí),將其傳代至24孔板中增殖,待細(xì)胞密度為80%時(shí),將其傳代至6孔板中增殖,待細(xì)胞密度為80%時(shí),將其傳代至T25瓶(一傳3)中增殖,每隔3天換液。
 
  細(xì)胞大量擴(kuò)增后,一瓶用于提取中RNA進(jìn)行QPCR檢測,一瓶用于總蛋白進(jìn)行WB檢測,另一瓶用于保種,根據(jù)QPCR和WB結(jié)果取舍陽性克隆。
 
  嘌呤霉素篩選細(xì)胞方法如上,具體的嘌呤霉素篩選細(xì)胞讓發(fā)如上,嘌呤霉素穩(wěn)定性高,可以常溫運(yùn)輸,收到產(chǎn)品后4℃存放;
 
  嘌呤霉素在室溫條件下可存放3個(gè)月,4℃條件下保質(zhì)期一年。為了達(dá)到理想的穩(wěn)定狀態(tài)和最長的保質(zhì)期,最好存放于-20°C,保質(zhì)期為2年。
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