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科普一下鈣離子熒光探針系列的三種使用方法

  科普一下鈣離子熒光探針系列的三種使用方法

  1、貼壁細胞

  A. 取普通潔凈蓋玻片于70%乙醇中浸泡5分鐘或更長時間,無菌超凈臺內(nèi)吹干或用細胞培養(yǎng)級PBS或0.9%NaCl等溶液洗滌三遍,再用細胞培養(yǎng)液洗滌一遍。將蓋玻片置于六孔板內(nèi),種入細胞培養(yǎng)過夜,使約為50%-80%滿。

  B. 刺激細胞發(fā)生凋亡后,吸盡培養(yǎng)液,加入0.5ml固定液,固定10分鐘或更長時間(可4℃過夜)。

  C. 去固定液,用PBS或0.9%NaCl洗兩遍,每次3分鐘,吸盡液體。洗滌時宜用搖床,或手動晃動數(shù)次。

  D. 加入0.5ml Hoechst 33258染色液,染色5分鐘。也宜用搖床,或手動晃動數(shù)次。

  E. 用PBS或0.9%NaCl洗兩遍,每次3分鐘。

  F. 滴一滴抗熒光淬滅封片液于載玻片上,蓋上貼有細胞的蓋玻片,盡量避免氣泡。使細胞接觸封片液,切勿弄反。

  G. 熒光顯微鏡可檢測到呈藍色的細胞核。激發(fā)波長在350nm左右,發(fā)射波長在460nm左右,詳細圖譜請參考下圖。

  2、懸浮細胞

  A. 離心收集細胞樣品于1.5ml離心管內(nèi),加入0.5ml固定液,緩緩懸起細胞,固定10分鐘或更長時間(可4℃過夜)。

  B. 離心去固定液,用PBS或0.9%NaCl洗兩遍,每次3分鐘。洗滌期間手動晃動。

  C. 后一次離心后吸去大部分液體保留約50ml液體,再緩緩懸起細胞,滴加至載玻片上,盡量使細胞分布均勻。

  D. 稍晾干,使細胞貼在載玻片上不易隨液體流動。

  E. 均勻滴上0.5ml Hoechst 33258染色液,染色5分鐘。用吸水紙從邊緣吸去液體,微晾干。

  F. 用PBS或0.9%NaCl洗兩遍,每次3分鐘。

  G. 滴一滴抗熒光淬滅封片液于載玻片上,蓋上一潔凈的蓋玻片,盡量避免氣泡。

  H. 熒光顯微鏡可檢測到呈藍色的細胞核。激發(fā)波長在350nm左右,發(fā)射波長在460nm左.

  3、組織切片

  A. 對于任何常見切片,處理至常規(guī)可以進行免疫染色時,或完成常規(guī)的免疫染色后,即可進行后續(xù)的Hoechst染色。B. PBS或0.9%NaCl洗兩遍,每次3分鐘,吸盡液體。洗滌時宜用搖床,或手動晃動數(shù)次。可在六孔板中操作。

  C. 加入0.5ml Hoechst 33258染色液,染色5分鐘。也宜用搖床,或手動晃動。

  D. 用PBS或0.9%NaCl洗兩遍,每次3分鐘。

  E. 將切片置于載玻片上,滴一滴抗淬滅封片液,蓋上一潔凈的蓋玻片,盡量避免氣泡。

  F. 熒光顯微鏡可檢測到呈藍色的細胞核。激發(fā)波長在350nm左右,發(fā)射波長在460nm左右,

  Hoechst 33258的吸收光譜和發(fā)射光譜,左側(cè)峰為吸收光譜,右側(cè)峰為發(fā)射光譜。

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